蛋白質(zhì)是一切活細(xì)胞和有機(jī)體的最重要和最必需的組成成分，它是構(gòu)成人體及所有動(dòng)物機(jī)體組織干物質(zhì)的主要部分。例如，人體按總量計(jì)算，干重54％是蛋白質(zhì)，即除去水分后，蛋白質(zhì)約占體重的一半左右，可見蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)中最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

       蛋白質(zhì)是由二十種氨基酸以肽鍵相互聯(lián)接而成的復(fù)雜的高分子化合物，它水解的最終產(chǎn)物是氨基酸。在蛋白質(zhì)分子內(nèi)又通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力構(gòu)成蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)的構(gòu)象（ conformation )。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子受到某些物理、化學(xué)因素影響時(shí)，它的空間結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生改變或破壞，物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)也隨著發(fā)生變化，稱為蛋白質(zhì)的變性作用。因此在研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能時(shí)，應(yīng)防止它的變性作用。

       蛋白質(zhì)在溶液中的分子大小，溶解度，電荷，吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等各不相同，根據(jù)這些因素，可以選擇一定的方法分離，制備和鑒定蛋白質(zhì)。利用蛋白質(zhì)肽鏈末端基的特點(diǎn)，還可以設(shè)計(jì)特殊的分析技術(shù)來測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

       氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，它也是生物體維持生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有特殊的生理作用，參與生物機(jī)體的代謝。因此對(duì)氨基酸的分離測(cè)定在實(shí)際工作中也是重要的。

       蛋白質(zhì)含量可從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重，紫外吸收、染色等測(cè)定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、 folin﹣酚試劑反應(yīng)、BCA法等方法來測(cè)定。其中 Folin ﹣酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)染色法是一般實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的方法。而 Folin﹣酚試劑法靈敏度較高，較紫外吸收法靈敏10~20倍，而較雙縮脲法靈敏100倍左右。這類方法操作簡(jiǎn)便、迅速，不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，又能適合一般實(shí)驗(yàn)室的要求，若作一般測(cè)定較為適宜。

       一、雙縮脲法

          1.原理

         在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍1~10mg蛋白質(zhì)。

         雙縮脲法于需要快速但并不需要十分精確的測(cè)定。硫酸銨不干擾此呈色反應(yīng)，使其有利于對(duì)蛋白質(zhì)純化早期步驟的測(cè)定。

         干擾此測(cè)定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，例如 Tris 緩沖液，因?yàn)樗鼈兘o予陽(yáng)性呈色反應(yīng)。Cu2+也容易被還原，有時(shí)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)紅色沉淀。

         2.器材

        蛋白的提?。筛鶕?jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整樣本量及比例） ①組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1：（5-10）的比例（建議稱取 0.1 g 組織，加 入 1 mL 提取液）處理樣品，冰浴勻漿，4℃ 10000 rpm 離心 10 min，取上清置于冰上待測(cè)。 ②細(xì)菌或細(xì)胞：離心收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL） 為（500-1000）：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1 mL 提取液）處理樣品，冰浴超聲破碎（功 率 300 W，超聲 3 s，間隔 7 s，總時(shí)間 3 min），4℃ 10000 rpm 離心 10 min，取上清置于冰上待測(cè)。 ③液體樣本：澄清無色液體樣品可以直接或使用提取液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

       測(cè)定過程中所需要的儀器和試劑：可見分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、研缽/勻漿器、可調(diào)式移 液器、臺(tái)式離心機(jī)和蒸餾水。

       3.注意事項(xiàng)

         待測(cè)樣本蛋白濃度須在 0.5-10 mg/mL 范圍內(nèi)，正式測(cè)定應(yīng)取 1-2 個(gè)差異樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保 蛋白濃度在此范圍內(nèi)，低于 0.5 mg/mL 則不能使用此法測(cè)定，高于 10 mg/mL 或吸光值大于 0.4 應(yīng)使用 Extract Solution 適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算時(shí)相應(yīng)修改。

       二、Folin﹣酚試劑法（Lowry法）

       1.原理

       用于蛋白質(zhì)測(cè)定的 Lowry 反應(yīng)是雙縮脲方法的發(fā)展，Lowry 蛋白含量檢測(cè)法是通過蛋白質(zhì)與銅離子在堿性條件下生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，進(jìn)一步將 Folin 試劑還原生成深藍(lán)色化合物，產(chǎn)物在 650 nm 處具有特征吸收峰，通過吸收值的變化即可定量檢 測(cè)樣品蛋白濃度。

       這個(gè)測(cè)定法較雙縮脲法靈敏得多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子同樣容易干擾Lowry反應(yīng)，而且對(duì)后者的影響還要大得多。所測(cè)蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。濃度較低的尿素（約0.5％左右）、胍（0.5％左右）、硫酸鈉（1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙的酸（0.5%)、乙的醇（5%)、（5%)、丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無影響，這些物質(zhì)濃度高時(shí)必須做校正曲線。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

       2.器材

       分光光度計(jì)    恒溫水浴

       3.檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)

       ①移液器移取少量液體時(shí)的誤差，會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度點(diǎn)造成影響，樣品點(diǎn)應(yīng)落在標(biāo)準(zhǔn)線 1/2 后；

       ②BSA Standard Solution 4℃保存有效期 3 個(gè)月，-20℃保存有效期一年，其他試劑室溫保存有效 期一年，試劑開封使用后請(qǐng)及時(shí)密閉保存；

       ③Lowry 法定量范圍為 50-500 µg/mL，F(xiàn)olin 試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起， 樣品若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使 顯色強(qiáng)度稍有不同；

       三、考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）

       1.原理

       1976年 Bradford 建立了用考馬斯亮藍(lán) G -250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，迅速、敏感的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收的改變，從465nm變?yōu)?95nm，光吸收增加。蛋白質(zhì)﹣染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度，最大低檢出量為1ug蛋白。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽(yáng)離子，如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4，乙的醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，而大量的去污劑如 TritonX -100, SDS 等嚴(yán)重干擾測(cè)定，少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。以下試劑對(duì)考馬斯亮藍(lán) G -250-蛋白質(zhì)復(fù)合物有影響：1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙的醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法簡(jiǎn)單迅速，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

       2.器材

       分光光度計(jì)     微量注射器

       檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)

       Bradford 法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中巰基乙的醇的濃度可 高達(dá) 1 M，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá) 5 mM；但受略高濃度的去垢劑影響，需確保樣品中 SDS 濃度低 于 0.1%，TritonX-100 低于 0.1%，Tween 20、60、80 低于 0.06%；

       四、BCA法

       1.產(chǎn)品描述

       BCA（Bicinchonininc Acid）蛋白含量檢測(cè)法是用于總蛋白質(zhì)定量的常用方法，BCA 與二價(jià)銅離 子混合即為 BCA 工作液，蛋白在堿性條件下能夠?qū)?Cu2+還原為 Cu+，Cu+與 BCA 試劑可形成紫色絡(luò) 合物，產(chǎn)物在 562 nm 處具有特征吸收峰，通過吸光值變化即可定量檢測(cè)樣品的蛋白濃度。

       2.注意事項(xiàng)

       ①Copper Solution 與 PBS Diluent 可置于 2-8℃長(zhǎng)期保存，若發(fā)現(xiàn)污染渾濁則應(yīng)丟棄；BCA Solution 在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時(shí)，可 37℃溫育使其*溶解，不影響使用；

       ②為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作；

       檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)

       ③BCA 法測(cè)定蛋白含量不受絕大部分樣品中化學(xué)物質(zhì)的影響，樣品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用濃度去垢劑不影響檢測(cè)結(jié)果，但 EDTA 和 EGTA 等螯合劑、DTT 和巰基 乙的醇等還原劑和脂類會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，需確保 EDTA 低于 10 mM、無 EGTA、二硫蘇糖醇低于 1 mM、 巰基乙的醇低于 0.01%；若樣品含有較多干擾物質(zhì)且本身背景值較高，建議使用 Bradford 法蛋白含量檢測(cè)試劑盒（Cat AKPR015）；

       ④若蛋白濃度較低時(shí)（小于 50 μg/mL），可將顯色溫度提高至 60℃且待測(cè)樣本

與工作液比例調(diào)整 為 1:8 進(jìn)行測(cè)定，能夠明顯提高靈敏度至 5 μg/mL；

       ⑤為保證結(jié)果準(zhǔn)確且避免試劑損失，測(cè)定前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書（以實(shí)際收到說明書內(nèi)容為準(zhǔn)）， 確認(rèn)試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備是否充分，操作步驟是否清楚，且務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)定，過程中問題請(qǐng)您及時(shí)與工作人員聯(lián)系。